2024, Vol. 50文章信息
- 何洁, 余婷婷, 梁松, 王冰, 李鹏, 殷果, 王炳志, 徐梅, 马红圳, 闫研, 严义勇
- HE Jie, YU Tingting, LIANG Song, WANG Bing, LI Peng, YIN Guo, WANG Bingzhi, XU Mei, MA Hongzhen, YAN Yan, YAN Yiyong
- 高通量高效快速净化方法结合UPLC-MS/MS测定粮食中黄曲霉毒素
- Determination of aflatoxins in grains using the high-throughput high efficient clean-up method and ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
- 中国测试, 2024, 50(5): 62-70
- CHINA MEASUREMENT & TEST, 2024, 50(5): 62-70
- http://dx.doi.org/10.11857/j.issn.1674-5124.2022100133
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文章历史
- 收稿日期: 2022-10-27
- 收到修改稿日期: 2022-12-09
2. 深圳职业技术大学集成电路关键材料研究院，广东 深圳 518055;
3. 深圳药品检验研究院，广东 深圳 518055;
4. 澳门大学中华医药研究院 中药质量研究国家重点实验室，澳门 999078
2. Institute of Critical Materials for Integrated Circuits, Shenzhen Polytechnic University, Shenzhen 518055, China;
3. Shenzhen Institute for Drug Control, Shenzhen 518055, China;
4. State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macau 999078, China
真菌毒素是由霉菌在生长或繁殖过程中产生的代谢产物，种类繁多，化学性质稳定，对农作物的污染无处不在，是当前全球重点关注的一类食品危害物，其中黄曲霉毒素是危害最严重的真菌毒素[1-2]。黄曲霉毒素（Aflatoxin, AF）是黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，具有很强的致畸、致癌、致突变性[3-4]。粮食农作物中黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 (AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)，其中黄曲霉毒素B1毒性和致癌性最强，被世界卫生组织的癌症研究机构定为I类致癌物。2017年我国国家食品药品监督管理局颁发了食品安全国家标准GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》，标准中规定黄曲霉毒素B1限量：小麦、大麦、小麦粉、麦片及其他去壳谷物、发酵豆制品为5 μg/kg，稻谷、糙米、大米为10 μg/kg，玉米、玉米面（渣、片）及玉米制品为20 μg/kg。
黄曲霉毒素的检测主要分为前处理和上机分析两步，检测分析方法又分为快速筛查和确证检测两类。快速筛查方法主要有胶体金免疫层析法[5-6]、酶联免疫试剂盒[7-9]、荧光定量法[10-11]和适配体传感器法[12-13]等，具有快速、简单以及成本低等特点，但无法准确定量，存在一定的假阳和假阴率。确证检测法主要有荧光共振能量转移法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法等[14-24]，液相色谱法受样品基质干扰较大，对前处理要求较高。液相色谱-串联质谱法由于具有灵敏度高、多组分同步检测、准确度高等优点，是目前真菌毒素确证方法的主流方法。前处理的方法主要有传统的固相萃取[25]、分散固相萃取[26]、基质分散固相萃取[27]、QuEChERS[28]、免疫亲和柱法[29]等。传统的固相萃取需要活化、上样、吸附、淋洗、洗脱等步骤，存在操作复杂、耗时费力、有机溶剂使用较多等缺点。免疫亲和柱法虽然能够有效去除样品杂质，具有良好的净化效果，但存在操作时间长、成本高等缺点。与前两者相比，QuEChERS、分散固相萃取操作较为简便，但因不存在理论塔板效应，其吸附杂质性能相对较弱一些。
近年来，以吸附杂质，目标物流穿为原理进行净化的技术逐渐兴起，净化柱为其中一种[30]。净化柱中的净化材料是由极性和非极性等多重复合填料组成，提取液中杂质在通过复合填料过程中被选择性吸附，而目标化合物则流穿过填料，得到净化后的提取液备用。该方法不需要活化、淋洗、洗脱等步骤，只需一步即可完成净化过程，具有一定的塔板数及良好的杂质吸附性能，且净化过程操作简单、快捷，已成功用于食品中真菌毒素的检测。
当下未见有相关的配合净化柱使用的仪器应用。针对传统净化柱使用过程中一次只能完成单个样品的净化，效率低，人工成本较高的现状，本文开发了一款高通量自动过柱仪，从而提升净化效率，降低人工成本，也为净化柱在未来大批量使用的情景提供一种思路。
本研究采用新型流穿式净化柱Speedy Prep®-Myco 1配套高通量自动过柱仪对粮食样品进行净化，使用超高效液相色谱-串联质谱进行检测。该前处理方法可于10 s内完成12管样品的净化，大大提高了检测效率，为粮食中黄曲霉毒素的检测提供了一种前处理简单、快速的方法。
1 实验部分 1.1 材料与试剂大米、小黄米、小麦、黄豆、面粉、大麦、黑米、花生、玉米基质样品购于深圳市农贸市场。
黄曲霉毒素B1标准溶液（100.6 μg/mL，青岛普瑞邦有限公司）；黄曲霉毒素B2标准溶液（100.2 μg/mL，青岛普瑞邦有限公司）；黄曲霉毒素G1标准溶液（100.6 μg/mL，青岛普瑞邦有限公司）；黄曲霉毒素G2标准溶液（25.08 μg/mL，青岛普瑞邦有限公司）；Speedy Prep®-Myco 1黄曲霉毒素净化柱（深圳市易瑞生物技术股份有限公司）；小麦粉中黄曲霉毒素B1（TMQC0037，50g/瓶，坛墨质检）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（美国Waters）；乙腈（色谱级，美国J. T. Baker公司）；甲酸（色谱级，阿拉丁试剂）；0.22 μm尼龙滤膜（天津艾杰尔有限公司）；色谱自动进样小瓶（浙江爱吉仁有限公司）。
1.2 仪器与设备AB SCIEX QTRAP 5500+ 超高效液相色谱-电喷雾电离源-串联质谱联用仪（美国SCIEX公司）；DM0412台式离心机（深圳市易瑞生物技术股份有限公司）；Milli-Q Synergy纯水机（美国默克）；IKA® MS 3 basic小型高速涡旋仪（德国IKA）；MTV-100多管涡旋混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）；D-160手持均质机（北京大龙）；XINW-M24高通量组织研磨仪（上海鑫翁科学仪器有限公司）；高通量自动过柱仪（深圳市易瑞生物技术股份有限公司）。
1.3 实验方法 1.3.1 标准溶液配制将标准品100.6 μg/mL 黄曲霉毒素B1、100.2 μg/mL 黄曲霉毒素B2、100.6 μg/mL 黄曲霉毒素G1、25.08 μg/mL黄曲霉毒素G2，用50%乙腈水溶液稀释配至1.000 μg/mL的混合标准溶液，于2~8℃保存备用，有效期1个月。
1.3.2 样品提取称取5 g经高通量组织研磨仪研磨的基质样品，加入20 mL提取液（84%乙腈-水溶液）混匀。高速涡旋3 min，放入离心机，4000 r/min离心2 min，上层清液为样品提取液。
1.3.3 样品净化向离心管中加入5 mL样品提取液，将净化柱橡胶头从离心管顶端插入离心管中，并向下压净化柱至离心管底端。将净化柱上部净化后的样品提取液倒出至EP管中，得到净化提取液。取净化提取液用初始流动相进行稀释，稀释后样品进行UPLC-MS/MS分析。
1.3.4 UPLC-MS/MS分析条件1) 液相条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）；柱温：40 ℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流量：0.35 mL/min；进样体积：10 μL；梯度洗脱程序：0.00~4.00 min，90%A~50%A；4.00~5.00 min，50%A~10%A；5.00~7.00 min，10%A~10%A；7.00~7.10 min，10%A~90%A；7.10~10.00 min，90%A~90%A。
2) 质谱条件
采用电喷雾正离子（ESI+）、多反应监测模式（MRM），喷雾电压IS：5.5 kV；喷雾气压力（GS1）：379.2 kPa；辅助气压力（GS2）：379.2 kPa；气帘气压力：241.3 kPa；离子源温度：550 ℃；将100 ng/mL的标准溶液注入质谱仪中，以待测物的准分子离子峰为母离子，通过优化碰撞能量、去簇电压等质谱参数，找出信号较强的2个特征子离子作为定性离子和定量离子，确定每种化合物的定性和定量离子对。
1.3.5 方法学考察1) 空白基质的选择
购买于市场的各种基质样品按照1.3.2、1.3.3的方法进行提取净化，UPLC-MS/MS进行定性及定量检测，未检测出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2为空白基质，用于后续的方法学验证。
2) 基质效应
空白标曲溶液配制：将1 μg/mL的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液用初始流动相梯度稀释成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 ng/mL的标准溶液。
基质标曲溶液配制：利用空白基质样品按照1.3.2、1.3.3进行前处理净化，得到的净化提取液进行相应稀释，再用其将1 μg/mL的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液稀释至0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 ng/mL基质标准溶液。基质效应由基质标曲的斜率与空白标曲的斜率比值来进行评价[31]。
| $ 基质效应=\dfrac{基质标曲斜率}{空白标曲斜率} $ | (1) |
3) 线性范围、检出限及定量限的测定
以空白基质为样品，参照1.3.2、1.3.3的步骤得到净化提取液，进行低浓度添加回收、UPLC-MS/MS分析，根据3倍信噪比的峰响应值得到该方法的检出限，根据10倍信噪比的峰响应值得到该方法的定量限和线性范围下限。同时，向空白基质样品净化提取液中添加黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液，配制成基质标准曲线，确定线性范围。
4) 添加回收率和精密度的测定
以空白基质为样品，添加一定量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液，参照1.3.1-1.3.4的前处理方法和仪器分析条件，进行六平行添加回收实验，并计算RSD。
2 结果与分析 2.1 色谱和质谱条件优化经优化的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2质谱参数见表1。
| 化合物 | 出峰时间/ min | 离子对 (m/z) | 碰撞能 量/eV | 去簇电 压/V |
| 黄曲霉毒素B1 | 4.16 | 313.1/241.1* | 49 | 150 |
| 313.1/269.0 | 40 | 150 | ||
| 黄曲霉毒素B2 | 3.91 | 315.0/287.0* | 37 | 150 |
| 315.0/259.0 | 40 | 150 | ||
| 黄曲霉毒素G1 | 3.90 | 329.0/243.0* | 37 | 140 |
| 329.0/283.0 | 35 | 140 | ||
| 黄曲霉毒素G2 | 3.65 | 331.0/245.0* | 41 | 160 |
| 331.0/257.0 | 41 | 160 | ||
| 注：1）“*”为定量离子对。 | ||||
采用ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）色谱柱进行黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和杂质的分离，比较了0.1%甲酸水-乙腈和0.1%甲酸水-甲醇流动相组成对其分离效果的影响，MRM色谱图见图1。可以看出，与乙腈相比，甲醇为流动相时，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的响应降低较为明显，不满足实际应用要求。随着甲酸浓度分别提升至0.2%、0.5%，4种分析物没有明显的信号增强效应。因此，出于经济因素考虑，0.1%甲酸水-乙腈为优选的流动相组成。
|
| 图 1 不同流动相条件下黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的MRM色谱图 |
2.2 震荡方式优化
本文以玉米为基质，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2添加水平为5 ng/mL，考察了IKA小型涡旋仪3000 r/min涡旋3 min（A）、多管涡旋混合仪2500 r/min涡旋20 min（B）、多管涡旋混合仪2500 r/min涡旋20 min后超声10 min（C）、手持均质机均质3 min（D）4种震荡提取方式的提取回收率以及基质效应的情况。添加回收率及基质效应的结果见表2。结果显示：4种震荡提取方式的回收率及基质效应基本一致，没有显著差异。
| 震荡 方法 |
添加回收率/% | 基质效应 | |||||||
| AFB1 | AFB2 | AFG1 | AFG2 | AFB1 | AFB2 | AFG1 | AFG2 | ||
| A | 90.03 | 93.25 | 109.0 | 87.33 | 0.95 | 0.95 | 1.00 | 0.88 | |
| B | 94.24 | 99.14 | 112.3 | 87.78 | 0.93 | 0.96 | 0.96 | 0.89 | |
| C | 80.91 | 98.88 | 96.39 | 88.94 | 0.88 | 0.93 | 0.95 | 0.90 | |
| D | 90.68 | 92.98 | 104.3 | 85.46 | 0.90 | 0.92 | 0.96 | 0.87 | |
2.3 稀释倍数优化
本文比较了稀释倍数对花生和黑米基质的影响，如表3所示，花生基质样品G2的基质效应值为0.77不在0.8~1.2的接受范围区间且回收率为75.53%。花生样品进行10倍稀释，4种黄曲霉毒素的回收率增加至87.31%~95.35%，基质效应比值范围为0.93~0.99，因此花生基质稀释10倍无需进行基质标曲校正。黑米基质的稀释倍数由5倍增至10倍后B1、B2、G1、G2回收率明显提升，基质效应对结果的影响减少。因此本文针对不同基质优化了各自的稀释倍数从而减少基质效应的影响，大米、小麦、小黄米、面粉、黄豆均稀释5倍，大麦、花生、黑米、玉米稀释10倍。
| 基质 名称 |
分析物 | 稀释5倍 回收率/% |
稀释10倍 回收率/% |
稀释5倍 基质效应 |
稀释10倍 基质效应 |
| 花生 | AFB1 | 91.06 | 95.35 | 0.94 | 0.99 |
| AFB2 | 83.69 | 88.08 | 0.86 | 0.98 | |
| AFG1 | 90.87 | 93.26 | 0.89 | 0.96 | |
| AFG2 | 75.53 | 87.31 | 0.77 | 0.93 | |
| 黑米 | AFB1 | 88.10 | 96.36 | 0.90 | 0.84 |
| AFB2 | 76.48 | 90.08 | 0.87 | 0.87 | |
| AFG1 | 75.68 | 106.3 | 0.79 | 0.94 | |
| AFG2 | 69.03 | 113.0 | 0.78 | 1.01 |
2.4 方法性能对比 2.4.1 检测方法对比
大麦基质经Speedy Prep®-Myco 1 净化柱净化后分别使用高效液相色谱（HPLC）及HPLC-MS/MS进行分析检测，HPLC色谱图前端及后端均有杂峰，杂质与目标分析物出峰位置较近，基质效应在HPLC上较大，定量结果易受杂质干扰。表4为两种方法在3个不同加标水平的回收率及RSD值，由表可见，HPLC-MS/MS在3个加标水平下的添加回收率范围为94.33%~114.8%，HPLC方法下G1的添加回收率在3个加标水平下都有一定程度的超标，低标情况下最为明显。因此本文建立的HPLC-MS/MS方法基质适用范围较HPLC更为广泛。
| % | |||||||||
| 检测方法 | 分析物 | 1 μg/kg | 5 μg/kg | 20 μg/kg | |||||
| 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | ||||
| HPLC-MS/MS | AFB1 | 94.33 | 5.3 | 99.04 | 3.2 | 96.25 | 3.5 | ||
| AFB2 | 105.8 | 6.6 | 100.8 | 3.3 | 98.85 | 3.6 | |||
| AFG1 | 101.9 | 4.5 | 97.65 | 2.7 | 96.41 | 3.6 | |||
| AFG2 | 114.8 | 7.6 | 101.3 | 3.1 | 98.72 | 1.8 | |||
| HPLC | AFB1 | 156.3 | 4.9 | 109.5 | 1.4 | 107.5 | 2.0 | ||
| AFB2 | 94.12 | 1.7 | 100.1 | 0.5 | 100.3 | 2.1 | |||
| AFG1 | 305.2 | 11 | 136.5 | 3.1 | 117.5 | 3.0 | |||
| AFG2 | 125.7 | 6.1 | 106.6 | 0.7 | 106.3 | 2.1 | |||
2.4.2 不同过柱方式对比
在传统净化柱使用过程中需人工手动将净化柱压入离心管，使提取液流穿过净化柱，其过程一次只能完成单个样品的净化，效率低，人工成本较高。基于此，开发了一款高通量自动过柱仪，为净化柱在未来大批量使用的情景提供一种思路。该仪器以铝材和钣金为结构主体，辅以电气运动元件和电子器件构成控制和传感单元。主要由底板，试管架、电机、控制系统、下压顶板、轴承组成。其中，电机控制系统[32]主要包括控制部分、外围电路，外围电路设计中又包含有复位电路和位置检测电路，复位电路用于实现关键状态的初始化，位置检测电路用于精确控制下压板下行位置。设备结构与实物如图2所示。操作过程如下：净化柱的橡胶头放置于装有提取液的离心管端口，后放入过柱仪试管架上启动按钮进行过柱，下压板向下压净化柱使得离心管中的提取液流穿净化柱的复合填料，填料上端流穿过的提取液即为净化后的提取液，倒出至样品瓶或样品管中，备用。在操作过程中，过程的位置检测等由传感器自动识别，并对正常和异常情况进行提示和报警。
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| 图 2 高通量自动过柱仪设计图及实物图 |
同时，比较了过柱仪过柱及人工手动过柱两种过柱方式、不同过柱速度对回收率及RSD的影响。实验结果表明两种过柱方式实验结果无明显差异，但使用过柱仪可一次在10 s内对12管样品进行过柱，使得整个前处理过程缩短至10 min以内，大幅提升净化效率，降低了人工成本。调节自动过柱仪电机使得过柱过程分别在10 s及25 s完成，其回收率及RSD如表5所示，在误差允许范围内均无明显差异，表明使用的净化柱在使用过程中受过柱速度影响较小、适用性强。
2.5 方法检出限和定量限
参照1.3.5的步骤，各种基质的检出限、定量限、线性范围及相关系数见表6。
| 基质名称 | 分析物 | 检出限/(μg∙kg–1) | 定量限/(μg∙kg–1) | 线性范围/(μg∙kg–1) | 回归方程 | 相关系数(R) |
| 大米、小黄米、小麦、黄豆、面粉 | AFB1 | 0.06 | 0.2 | 0.20~20.00 | y =1.21388×105x +482.75057 | 0.9998 |
| AFB2 | 0.06 | 0.2 | 0.20~20.00 | y=3.61595×105x +1237.87247 | 0.9996 | |
| AFG1 | 0.06 | 0.2 | 0.20~20.00 | y =3.39061×105x +1500.66976 | 0.9997 | |
| AFG2 | 0.06 | 0.2 | 0.20~20.00 | y =1.44416×105x +179.08975 | 0.9998 | |
| 大麦、黑米、花生、玉米 | AFB1 | 0.12 | 0.4 | 0.40~40.00 | y =1.22609×105x -109.86874 | 0.9997 |
| AFB2 | 0.12 | 0.4 | 0.40~40.00 | y =3.60643×105x +1699.83176 | 0.9994 | |
| AFG1 | 0.12 | 0.4 | 0.40~40.00 | y =3.38419×105x +1812.01327 | 0.9995 | |
| AFG2 | 0.12 | 0.4 | 0.40~40.00 | y =1.45624×105x -407.12867 | 0.9993 |
2.6 基质效应
按照1.3.5的方法进行不同基质的基质效应计算，结果见表7，不同基质黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的基质效应在0.81~1.08之间，说明本文建立的分析方法净化效果良好，基质干扰较小。因此，本文的回收率数据是根据空白标准溶液标曲计算而得，无需基质标曲校正。
| 基质名称 | 基质效应 | |||
| AFB1 | AFB2 | AFG1 | AFG2 | |
| 大米 | 0.86 | 0.91 | 0.97 | 0.84 |
| 小黄米 | 0.81 | 0.88 | 1.07 | 0.87 |
| 小麦 | 0.93 | 0.96 | 0.95 | 0.88 |
| 黄豆 | 0.95 | 1.05 | 1.00 | 0.88 |
| 面粉 | 0.98 | 1.00 | 1.08 | 1.04 |
| 大麦 | 0.88 | 0.94 | 0.82 | 0.88 |
| 黑米 | 0.84 | 0.87 | 0.94 | 1.01 |
| 花生 | 0.99 | 0.98 | 0.96 | 0.93 |
| 玉米 | 0.85 | 0.84 | 0.81 | 0.85 |
2.7 回收率与精密度
以空白基质为样品，根据表6不同基质的线性范围作添加回收实验，验证了不同基质的添加回收率及精密度，具体结果见表8。从表中可以看出，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2大米、小黄米、小麦、黄豆、面粉基质的0.2、1、10、20 μg/kg添加浓度下，平均回收率为77.69%~113.5%，RSD为2.0%~14%，大麦、黑米、花生、玉米基质的0.4、1、10、20 、40 μg/kg添加浓度下，平均回收率为72.37%~118.4%，RSD为0.64%~11%。由此可见，本文利用流穿式净化柱前处理法测得的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的准确度以及精密度良好。
| % | |||||||||||||||
| 加标浓度/(μg∙kg–1) | 分析物 | 大米 | 小黄米 | 小麦 | 黄豆 | 面粉 | |||||||||
| 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | ||||||
| 0.2 | AFB1 | 95.51 | 4.4 | 98.26 | 3.5 | 99.11 | 10 | 97.49 | 5.1 | 92.89 | 7.1 | ||||
| AFB2 | 98.19 | 6.5 | 92.33 | 2.4 | 97.64 | 9.2 | 98.35 | 6.9 | 100.1 | 6.8 | |||||
| AFG1 | 109.2 | 5.7 | 101.2 | 3.2 | 97.19 | 11 | 108.2 | 8.5 | 100.8 | 7.8 | |||||
| AFG2 | 96.42 | 10 | 91.44 | 5.6 | 97.56 | 8.2 | 86.43 | 14 | 85.85 | 7.4 | |||||
| 1 | AFB1 | 96.36 | 7.7 | 82.01 | 12 | 97.37 | 10 | 96.81 | 5.8 | 89.66 | 8.1 | ||||
| AFB2 | 102.3 | 5.6 | 77.69 | 12 | 91.39 | 11 | 95.73 | 10 | 96.58 | 6.7 | |||||
| AFG1 | 113.5 | 8.2 | 94.74 | 8.8 | 87.80 | 11 | 107.1 | 9.8 | 101.8 | 6.8 | |||||
| AFG2 | 104.2 | 8.2 | 99.16 | 6.5 | 95.22 | 8.6 | 91.76 | 3.1 | 86.28 | 5.4 | |||||
| 10 | AFB1 | 91.08 | 7.1 | 92.23 | 10 | 90.36 | 10 | 94.08 | 6.5 | 101.6 | 5.8 | ||||
| AFB2 | 90.33 | 4.4 | 89.08 | 5.8 | 87.05 | 5.4 | 95.17 | 4.8 | 95.59 | 6.4 | |||||
| AFG1 | 110.1 | 7.3 | 110.8 | 5.8 | 101.0 | 4.7 | 108.8 | 3.2 | 105.6 | 3.0 | |||||
| AFG2 | 85.79 | 7.8 | 94.38 | 5.1 | 85.83 | 3.8 | 90.69 | 6.3 | 89.28 | 4.5 | |||||
| 20 | AFB1 | 98.04 | 7.3 | 87.21 | 7.5 | 87.78 | 3.1 | 97.30 | 6.1 | 106.5 | 3.1 | ||||
| AFB2 | 91.28 | 5.8 | 84.03 | 5.5 | 87.08 | 2.0 | 94.65 | 5.2 | 98.06 | 5.4 | |||||
| AFG1 | 106.8 | 7.2 | 101.6 | 4.6 | 97.95 | 3.1 | 106.7 | 6.1 | 107.6 | 2.6 | |||||
| AFG2 | 86.99 | 4.1 | 92.38 | 4.0 | 83.60 | 4.6 | 97.28 | 4.2 | 95.88 | 5.0 | |||||
| 续表8 本方法不同基质添加回收率及精密度（n=6） | ||||||||||||
| % | ||||||||||||
| 加标浓度/(μg∙kg–1) | 分析物 | 大麦 | 玉米 | 黑米 | 花生 | |||||||
| 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | 回收率 | RSD | |||||
| 0.4 | AFB1 | 93.86 | 6.7 | 93.56 | 6.2 | 95.82 | 2.3 | 96.19 | 2.7 | |||
| AFB2 | 109.4 | 5.1 | 81.71 | 9.1 | 89.67 | 3.3 | 86.79 | 5.2 | ||||
| AFG1 | 101.8 | 3.7 | 91.26 | 7.5 | 98.19 | 3.7 | 94.62 | 7.2 | ||||
| AFG2 | 117.2 | 7.5 | 84.38 | 6.1 | 89.56 | 4.2 | 89.59 | 2.5 | ||||
| 1 | AFB1 | 94.33 | 5.3 | 86.08 | 5.2 | 92.26 | 9.8 | 89.95 | 3.5 | |||
| AFB2 | 105.8 | 6.6 | 83.17 | 8.1 | 90.34 | 11 | 85.59 | 6.7 | ||||
| AFG1 | 101.9 | 4.5 | 93.84 | 5.7 | 108.2 | 10 | 97.31 | 8.9 | ||||
| AFG2 | 114.8 | 7.6 | 83.69 | 4.3 | 118.4 | 8.7 | 91.30 | 8.5 | ||||
| 10 | AFB1 | 99.04 | 3.2 | 91.36 | 4.4 | 92.37 | 4.7 | 97.59 | 3.1 | |||
| AFB2 | 100.8 | 3.3 | 84.28 | 6.5 | 95.84 | 1.8 | 92.89 | 2.6 | ||||
| AFG1 | 97.65 | 2.7 | 92.39 | 4.5 | 108.6 | 3.1 | 96.76 | 3.4 | ||||
| AFG2 | 101.3 | 3.1 | 89.37 | 3.6 | 112.7 | 1.2 | 88.06 | 2.8 | ||||
| 20 | AFB1 | 96.25 | 3.5 | 89.22 | 2.7 | 96.36 | 3.0 | 95.35 | 0.64 | |||
| AFB2 | 98.85 | 3.6 | 83.34 | 4.0 | 90.08 | 1.7 | 88.08 | 1.7 | ||||
| AFG1 | 96.41 | 3.6 | 88.30 | 2.8 | 106.3 | 3.6 | 93.26 | 1.8 | ||||
| AFG2 | 98.72 | 1.8 | 84.79 | 4.2 | 113.0 | 3.5 | 87.31 | 3.0 | ||||
| 40 | AFB1 | 94.19 | 7.4 | 91.94 | 2.8 | 89.64 | 3.4 | 103.4 | 9.7 | |||
| AFB2 | 114.6 | 8.9 | 83.61 | 3.1 | 79.28 | 2.2 | 96.85 | 8.1 | ||||
| AFG1 | 83.75 | 5.7 | 75.37 | 2.7 | 72.37 | 4.1 | 104.6 | 4.2 | ||||
| AFG2 | 109.5 | 8.3 | 90.48 | 3.5 | 86.69 | 2.1 | 109.1 | 4.4 | ||||
2.8 质控品分析
对质控品小麦粉（TMQC0037）中的黄曲霉毒素B1进行测试，质控品AFB1指定值范围为(38.7±2.4) μg/kg，应用本方法平行8次测试，测试结果为38.8 μg/kg，测试值落于指定区间内，且RSD为1.5%，重复性优异。
3 结束语本研究采用流穿式净化柱，结合开发的高通量自动过柱仪对粮食中杂质进行净化，采用UPLC-MS/MS进行定性及定量分析，建立了粮食中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的确证检测方法。与传统免疫亲和柱方法相比，本方法前处理操作简便，净化速度快。配合使用自动过柱仪可在10 s内完成12个样品的净化处理，整个前处理过程缩短至10 min以内。
在大米、小黄米、小麦、黄豆、面粉、大麦、黑米、花生、玉米基质中，在0.2、0.4、1、10、20、40 μg/kg添加回收率为72.37%~118.4%，相对标准偏差（RSD，n=6）为0.64%~14%，可见本文方法适用基质广泛，回收率高，稳定性及精密度好，可为粮食中黄曲霉毒素的监管提供技术支持。
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