0 引　言

牦牛是青藏高原及相邻地区一种特有的乳牛品种，生活在高海拔、氧含量低且没有工业污染的地区^[1]。相较于普通牛奶，牦牛奶中脂肪、蛋白质、乳糖、维生素和必须氨基酸含量高，脂肪酸种类多，胆固醇含量较低，同时还具有一定的抗氧化能力。虽然牦牛奶具有多种优点，但因其膻味，不少消费者对牦牛奶接受度较低。将牦牛奶经发酵制成酸奶产品，在弱化膻味的同时优化了其营养价值，降低牦牛奶中乳糖的含量，有利于乳糖不耐受人群^[2]。由于高原地区地理条件特殊、交通闭塞等原因，当地酸奶加工没有规模的生产加工设备以及深加工技术，生产出的牦牛酸奶比较粗糙，无法大规模流入市场^[3]。迄今为止，牦牛酸奶工艺仅有少量的研究报道，冶成君^[4]等对比分析了普通酸奶和牦牛酸奶发酵特性，李升升^[5]等基于标准化法评估牦牛酸奶加工工艺。目前牦牛酸奶更多的研究报道集中在菌株分离、复合型酸奶工艺方面^[6-7]，且风味物质研究多集中于使用一维气相质谱联用仪，然而受到其峰容量和分辨率的限制，检测时会出现化合物共留的现象，鉴定的挥发性成分往往低于100种，使用全二维气相色谱/质谱联用仪分析则可有效解决该问题。目前使用全二维气相色谱/质谱联用仪对酸奶中挥发性组分的研究尚未见报道。因此，本文以牦牛奶粉为原料，采用响应面法对牦牛酸奶的发酵工艺参数进行优化，并结合全二维气相色谱/质谱联用仪分析其风味物质特征，期望为牦牛酸奶的研发提供基础数据和参考依据。

1 材料和方法 1.1 材料与试剂

牦牛奶粉：西部牦牛集团；奶粉：雀巢中国有限公司；白砂糖：市售；益生菌型酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）：安琪酵母股份有限公司；MRS肉汤：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；MC培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器及设备

恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；水浴锅，江苏省金坛市医疗器械厂；高速冷冻离心机，美国Thermo公司；电子分析天平，中国北京赛多利斯仪器系统有限公司；粘度仪，上海尚仪仪器设备有限公司；TA-XT2i型质构仪，英国Stable Micro System有限公司；电子鼻，德国AIRSENSE-PEN3；GC-MS2020NX-全二维，日本岛津公司；手动进样手柄，SAAB-57330U SPME。

1.3 响应面法优化工艺

按照刘绒梅^[8]报道的酸奶制作工艺流程，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken组合试验设计原理，选取对牦牛酸奶品质影响较大的复水比例、蔗糖添加量、杀菌工艺、发酵时间4个因素的较好水平进行响应面试验的设计^[9]。以感官评分为响应值，使用Design Expert软件处理数据构建模型，获得牦牛酸奶最佳工艺条件。响应面试验各因素选定水平如表1所示。

1.4 牦牛酸奶感官评价

邀请10名同学对牦牛酸奶进行评价分析，分别从色泽、气味、滋味、组织状态进行评分，参照GB 19302—2010《发酵乳》以及白丽娟等^[10]方法制定感官评分标准表，如表2所示。

1.5 检测指标

1.5.1 酸度

依照食品安全国家标准GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》进行测定。

1.5.2 持水力

参照卢孝洁等^[11]的方法，量取10 mL酸奶放入离心管。离心管质量记w₁，加入酸奶后的质量记为w₂，离心速度为6000 r/min，离心10 min，静置10 min，吸去上清液，此时质量记为w₃。持水力计算公式：M=(w₃–w₁)/(w₂–w₁)×100%。

1.5.3 粘度

使用上海尚仪仪器设备有限公司生产的NDJ-5S数显粘度计，4# 号转子进行测定，转速60 r/min，测定时间为30 s。

1.5.4 质构特性的测定

采用质构仪在剖面质构分析模式（Texture Profile Analysis, TPA）模式下，对牦牛酸奶进行质构测试，TPA模式能够全面且准确地描述酸奶样品的质地特征。参照李丽等^[12]的方法并进行修改，质构测定参数为：P0.5探头，测前速度：1.00 mm/s，测中速度：1.00 mm/s，测后速度：10.00 mm/s，位移5 mm，触发力5 g。

1.5.5 乳酸菌活菌数

依照食品安全国家标准GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行测定。

1.6 全二维气相色谱/质谱联用仪测试

参考Chen^[13]等的方法，称取3 g酸奶分别放入15 mL顶空进样瓶中，用PTFE-silicone瓶盖密封。50 ℃恒温平衡20 min后，萃取头在50 ℃萃取30 min，萃取结束后在GC进样口（250 ℃）解吸3 min进行GC×GC-MS分析。每个样品分别做5次平行。柱箱温度40 ℃；进样口温度250 ℃；进样时间2.5 min。

GC×GC条件：进样口温度250 ℃；不分流进样；一维色谱柱 DB-WAX（36.4 m×0.25 mm×0.25 μm），二维色谱柱DB-17MS（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）。载气为氦气（99.999%）；柱流量为1 mL/min；柱箱温度采用程序升温：起始温度40 ℃，保持 2 min，然后以5 ℃/min升温到230 ℃，保持4 min。

全二维气相调制器：采用固态热调制器，选择HV调制柱（1.2 m×0.25 mm），调制周期为4 s，其中解析时间为1 s。

MS条件：电子轰击离子源（Electron Impact Ion Source ，EI），离子源温度200 ℃，接口温度240 ℃，电子能量70 eV；溶剂延迟2.5 min后采集信号；全扫描检测模式，质量扫描范围 m/z 41～330。

1.7 数据分析

每组试验均重复三次，使用 Excel 2016 和 SPSS 软件处理试验数据并进行统计分析。使用Design Expert 8.0.6、WinMuster、Canvas Panel、Origin 2018软件用于实验图表的绘制。

2 结果和分析 2.1 响应面优化

2.1.1 响应面试验设计及结果

建立Box-Behnken 中心组合试验设计，以复水比例(A)、蔗糖添加量(B)、杀菌工艺(C)、发酵时间(D)为特征值，感官评分为响应值(Y)，优化牦牛酸奶的工艺参数^[14]。试验结果如表3所示。

2.1.2 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert V11.1.2.0 软件对表3数据进行多元回归拟合，得到牦牛酸奶感官评分对复水比例(A)、蔗糖添加量(B)、杀菌工艺(C)、发酵时间(D)的二次方程模型为：

回归模型方差分析表如表4所示。

由表4知，回归模型的 F=82.75，P<0.000 1，说明牦牛酸奶的感官评分与四个因素之间的回归方程极显著。失拟项P>0.05，说明模型可靠。模型交互项AC、BC、BD的P值<0.05，对感官评分影响显著。一次项A、B、D和交互项AB、AD、CD影响不显著（P>0.05）。一次项C 与二次项 A²、B²、C²、D²对感官评分的影响极显著（P<0.01）。

根据 F值的大小，可以看出各因素对牦牛酸奶感官评价的影响顺序为：杀菌工艺(C)>发酵时间(D)>蔗糖添加量(B)>复水比例(A)。

2.1.3 最佳条件的确定及验证

利用Design Expert对结果进行计算，整理分析后得出牦牛酸奶的最佳生产工艺为：复水比例1∶7.949、蔗糖添加量7.081%、杀菌工艺为83.593 ℃/15.47 min、接种量为1 g/L、发酵温度42 ℃、发酵时间8.092 h，此时感官评分95.888。考虑实际操作情况，将复水比例调整为1:8，蔗糖添加量调整为7%，杀菌工艺调整为85 ℃/15 min，发酵时间调整为8 h。在调整后的最佳配方上进行验证试验，得到的牦牛酸奶感官评分值为96.13。实际值与理论值接近，说明该模型得到的优化参数准确性高。

2.2 牦牛酸奶指标检测及乳酸菌活菌数测定

在最优生产工艺条件下，对牦牛酸奶进行指标检测，并测定乳酸菌活菌数，结果见表5。

2.3 挥发性风味物质分析

为进一步明晰牦牛酸奶特有香气组成及其风味特征，本部分使用全二维气相色谱/质谱联用仪对牦牛酸奶、普通酸奶（按牦牛酸奶工艺制备）以及市售的三种酸奶的挥发性组分种类及含量进行对比分析。将全二维数据载入Canvas 软件中，绘制全二维 TIC 轮廓图，设置参数信噪比大于50的峰自动识别，标识出的每一个峰点代表一种化合物，每个化合物由一对保留时间确定，X 轴方向为第一维保留时间(min)，Y 轴方向为第二维保留时间(s)。将化合物的质谱图与在Canvas 软件内NIST20标准质谱数据库进行比对检索、结合保留指数（Retention index，RI）等信息，对风味物质进行定性分析。

采用 SPME法进样，5种酸奶挥发性成分进行GC × GC-MS 分析得到的二维总离子流如图1所示。图中峰点即物质，颜色越深表示该物质强度越大则浓度相应越大。结果表明5种酸奶虽然风味成分分布大体一致，但牦牛酸奶峰点明显多于其他4种酸奶，峰点颜色也深于其他4种，说明牦牛酸奶中挥发性风味物质及含量比4种酸奶多，其中牦牛酸奶样品中的挥发性风味物质共180种，包括烷烃类57种，烯烃类16种，酮类5种，酚类1种，胺类2种，醚类6种，呋喃类1种，醇类29种，酯类14种，醛类5种，酸类26种、炔烃类2种以及其他芳香、杂环类和含硫类化合物物质16种。普通酸奶中含151种，市售一、二、三分别为161、133以及 126种。这可能是由于牦牛奶中脂肪、蛋白质、乳糖、维生素、必须氨基酸、脂肪酸种类优于普通牛奶，经发酵剂发酵形成了浓厚且独特的风味。

由图2和表6可知，牦牛酸奶在烷烃类、烯烃类、醇类、酯类以及酸类物质的数量和总含量上占据优势，但因为各种风味之间呈味阈值不同所以在风味贡献度有一定的差别。下面分别对不同类型风味物质对牦牛酸奶感官的影响进行简要分析：1）呋喃类化合物是酸奶的重要风味物质之一，能够反映酸奶风味质量。乳制品经贮藏可产生各种呋喃类化合物^[15]，牦牛酸奶、普通酸奶及两种市售酸奶都存在呋喃类化合物，包括2,2,4,4-四甲基四氢呋喃、3-甲基苯并呋喃等。4种酸奶呋喃数量一致但实际峰面积差异较大，其中牦牛酸奶实际峰面积最大，达到3965472.16。2）醛类化合物很快会还原成醇及相应的酸，因此醛类物质在酸奶中存留时间很短，检测到的数量也相应较少，但醛类组分对于酸奶的风味同样有重要的影响^[16]。牦牛酸奶实际峰面积最大，达到21939063。牦牛酸奶中检测出的(E)-2-壬稀醛具有黄瓜味和西瓜味，(Z)-2-壬烯醛具有脂肪气息和青草香味，苯甲醛具有苦杏仁味，这些醛类物质对牦牛酸奶的整体风味具有积极作用。3）醇类化合物风味柔和并且阈值高，所以对酸奶的风味贡献度不大。在牦牛酸奶中乙醇的峰面积大，为7018563.34，而其他4种酸奶仅在市售三中检出乙醇，乙醇具有特殊的、令人愉快的酒香味，丰富的醇类物质使牦牛酸奶呈现区别于其他四种酸奶的醇香口味。4）酸类化合物作为酸奶的主要风味物质主要表现在滋味上，气味表现不如其他风味物质明显。牦牛酸奶中酸类化合物主要以丁酸为主，实际峰面积2621806.9，丁酸具有奶酪味，酸类化合物随着碳原子数目的增加挥发性逐渐下降，风味特征逐渐变得以酸臭为主^[17]。辛酸、癸酸是体现牦牛奶本身特有风味的主要脂肪酸，具有牦牛奶特有的风味，而在牦牛酸奶中未检测出上述两种酸，这或许是牦牛奶经发酵后膻味减轻的原因。5）酯类化合物是乳制品香气的重要组成成分之一，主要由牛乳脂肪酸经水解、微生物代谢产生。大部分酯类化合物风味阈值很低，因此呈味明显，对风味作用很大。5种酸奶中牦牛酸奶酯类数量不是最多但实际峰面积最大，为12731542.01，其中乙酸正丙酯实际峰面积8055627.2，贡献主要风味成分，乙酸正丙酯具有甜润的水果香气。6）酮类物质呈味阈值低，是酸奶风味组分中不可缺少的，一般多由不饱和脂肪酸氧化产生，呈奶油味或果香味。5种酸奶中市售二酸奶中实际峰面积最大，9026739099；牦牛酸奶居第二，为4989674403。丁二酮、甲基酮是酸奶的主要风味物质，在牦牛酸奶中只检出了丁二酮，峰面积188299161.6，未检出甲基酮，二者整体小于其他4种酸奶，所以牦牛酸奶奶香味弱于普通酸奶。不同种类的化合物产生不同的香气，各种香气相互协调使得牦牛酸奶的风味更加饱满。此外，研究比较5种酸奶风味物质，发现牦牛酸奶中含有1-甲基环庚醇、反式-2-壬醛、3,5-二烯-2-酮、4-甲基-5-癸醇、4-乙基苯甲醛-二碳酸二叔丁酯、10-甲基-二十烷、N-羧苄氧基-l-酪氨酸-l-缬氨酸、二甲基砜、2,6,10-三甲基-十四烷等10种特有风味物质。

3 结束语

本文通过响应面试验，对牦牛酸奶的发酵工艺参数进行优化，确定了最佳发酵工艺条件为：复水比例1:8、蔗糖添加量7%、杀菌工艺为85 ℃/15 min、接种量为1 g/L、发酵温度42 ℃、发酵时间8 h。此条件下产品的滴定酸度95.41 °T、持水力57.53%、粘度9065 mPa·s、硬度45.21 g、黏性26.16 mJ、内聚性0.51、弹性0.95 mm、乳酸菌活菌数2.74×10⁶ CFU/mL。产品黏稠度极佳，无乳清析出，口感爽滑，滋味酸甜适中，有独特的牦牛酸奶香味，并且无膻味。通过全二维气相色谱/质谱联用仪分析得到牦牛酸奶中含有180挥发性风味物质，数量及总含量都多于普通酸奶以及市售的3种酸奶，且具有10种特有的风味物质。本研究可以为牦牛酸奶的进一步研发提供基础数据和理论参考。