0　引　言

手性仲醇是一类重要的有机官能团结构，在许多生物活性化合物和药物结构中高频出现，如平喘药（R）-沙丁胺醇、强心药（R）-地诺帕明、抗抑郁药（R）-托莫西汀等^[1-3]。鉴于手性仲醇重要的药理用途，发展其高效的制备技术一直是催化领域的研究热点之一^[4-5]。手性仲醇一般可由相应的酮经不对称催化氢化制得，诱导不对称氢化的催化剂主要有金属催化剂、有机小分子催化剂和生物催化剂3种^[6-8]。其中，生物催化剂因反应条件温和、产物立体选择性高、对环境友好等优点，近十年来备受关注^[9-10]。现用于不对称合成手性仲醇的生物催化剂主要来自微生物^[11-12]，其胞内氧化还原酶和辅酶NAD（P）H（提供氢原子）的共同作用将前手性酮分子中的羰基不对称还原，生成具有光学活性的手性仲醇^[13-15]。然而，生物催化的底物多为脂溶性的有机化合物，现有的微生物来源酶亲脂性普遍较差，很难与脂溶性底物结合，这是导致生物催化底物转化率低、产物累积量不高，最终无法实现其工业化应用的关键所在。因此，开发新型亲脂性生物催化剂，在不对称催化领域具有广阔的市场前景和较高的经济价值。

本课题组前期利用模式底物苯乙酮，从成都市某化工厂的污水处理池及其附近土壤中筛选可催化苯乙酮不对称还原的微生物菌株。初筛获得的224株形态各异菌株中，解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica CCTCC CM2013606是唯一一株特异性制备（R）-手性仲醇的微生物催化剂^[16]，这与“自然中的生物催化剂所催化的产物大多数是（S）-构型，（R）-构型较少”^[17]的结论一致。Y. lipolytica是一种非常规酵母菌，安全无毒、适应疏水环境、对甘油酯和烷烃类等有机溶剂有较强的耐受力^[18]。目前，解脂耶氏酵母常用于治理有机废水，其胞内酶也被认为具有良好的亲脂性^[19-20]，而有关Y. lipolytica不对称催化的研究相对较少^[21]。本文以Y. lipolytica CCTCC CM2013606全细胞为催化剂，在明确其不对称合成（R）-苯乙醇的各种影响因素基础上，建立解脂耶氏酵母不对称合成（R）-苯乙醇的最佳转化条件，为微生物催化法的工业化应用提供理论及实验依据。

1 材料与仪器 1.1 药品与试剂

苯乙酮及其衍生物、（R/S）-苯乙醇均购自成都蜀都化学试剂公司，纯度99%；（S）-苯乙醇、（R）-苯乙醇标准品购自Sigma-Aldrich，ChiraSelect，≥99.0%（sum of enantiomers，GC）；其他试剂均为市售分析纯或生物试剂。

1.2 菌株及各种培养基

利用底物诱导方法，从成都某手性化工厂污水处理池附近采集的土壤中筛选到一株可将模式底物苯乙酮不对称还原成（R）-苯乙醇的解脂耶氏酵母菌株，现保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，编号CM2013606，即解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica CCTCC CM2013606。

斜面培养基（PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂粉 17 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。种子培养基（YPD）：葡萄糖 10 g/L，酵母膏 5 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。发酵培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，葡萄糖 20 g/L，（NH₄）₂SO₄ 5 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。上述培养基的灭菌条件均为115 ℃，30 min。

1.3 仪　器

超净工作台（苏净集团安泰公司SW-CZ-1F）；GC-960气相色谱仪，HP Chiral 10% 3-Cyclodextrin手性色谱柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）；全自动高压蒸汽消毒器（上海三申医疗器械有限公司YX280A）；隔水式电热恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司ZHWY-211C型）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；低速离心机（北京医用离心机厂）。

2 方　法 2.1 菌体细胞培养及收集

从活化好的菌种斜面上刮1环菌苔接种于20 mL种子培养基中，30 ℃，170 r/min摇床培养24 h。从培养好的种子液中吸取2.5 mL转接到50 mL发酵培养基中，30 ℃，170 r/min的摇床培养48 h后，将发酵液于4 ℃，6 000 r/min，离心10 min，收集菌体细胞。再将菌体细胞悬浮于0.1 mol/L pH 6.6磷酸缓冲液中，充分混匀后再次离心，收集菌体细胞，重复上述操作2次后将收集的菌体细胞转入20 mL pH 6.6磷酸缓冲液中，加入苯乙酮至底物终浓度为60 mmol/L，同时加入2%（w/v）葡萄糖作为辅助底物，并于30 ℃，170 r/min振摇条件下，反应24 h。

2.2 产物GC分析

还原反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取（1:1, v/v），再用无水MgSO₄干燥后使用GC-960气相色谱仪进行产物分析。检测条件：载气为氮气，进样器、色谱柱和FID检测器温度分别为220 ℃、110 ℃和200 ℃；分流比为1:100；进样量为0.1 mL。分别以底物的转化率（Conversion）和产物的对映体过量值（e.e. value）表示反应的转化程度和立体选择性，其表达式如下所示：

其中C₀为底物的初始浓度，C_苯乙醇为反应终止时的产物浓度，C_R和C_S分别为（R）型和（S）型产物的浓度。

2.3 转化条件优化

利用单因素方法，探究几个重要变量对不对称还原反应的影响，包括转化时间、辅助底物及其浓度、温度、初始pH、细胞浓度、底物浓度、底物助溶剂等。并以获得底物转化率和产物e.e.值为衡量指标，最终建立解脂耶氏酵不对称合成（R）-苯乙醇的最佳转化条件。

3 结　果 3.1 转化时间对不对称还原反应的影响

当转化时间分别为24，28，32，36，40，44，48，52，56，60 h时，比较获得的底物转化率及产物e.e.值，以确定Y. lipolytica CCTCC CM2013606催化不对称还原反应的最佳转化时间。结果如图1所示，底物转化率在前36 h逐渐增高，而36 h至44 h趋于稳定，44 h后开始下降。分析原因可能是未反应的底物和不断积累的产物对菌体细胞产生抑制作用，从而导致胞内氧化还原酶催化活性的下降。鉴于转化时间对产物e.e.值几乎无影响，故确定最适转化时间为36 h。

3.2 辅助底物及其添加剂量对不对称还原反应的影响

以Y. lipolytica CCTCC CM2013606全细胞用作催化剂时，不必向反应体系中额外添加昂贵的辅酶NAD（P）H。这是因为氧化还原酶所需的辅酶可通过微生物细胞分解代谢廉价的葡萄糖、甘油等能量物质而获得，这也是微生物细胞催化的优势之一。因此，在反应体系中按2%的质量浓度分别添加葡萄糖、甘油、正丁醇、异丙醇、无水乙醇、甲醇、乳酸7种辅助底物。结果如图2（a）所示，以甘油为辅助底物时，获得的底物转化率最高，葡萄糖次之；以乳酸或正丁醇为辅助底物时，获得的底物转化率低于空白对照。这可能是乳酸和正丁醇对解脂耶氏酵母胞内的氧化还原酶活性产生一定的抑制作用。因此，甘油被确定为最佳辅助底物。为确定甘油的最佳浓度，考察了不同浓度的甘油对转化反应的影响。结果如图2（b）所示，反应体系中未添加甘油时，Y. lipolytica CCTCC CM2013606全细胞也能催化不对称还原反应，但转化的底物量相对较少。这是因为菌体细胞经过前期的培养，胞内累积了一定量的能量物质，经过这些能量物质的代谢作用也可产生少量还原型辅酶。但由于能源未及时补充，反应体系中缺少氧化还原所必须的辅酶，导致获得的底物转化率较低。随着甘油浓度的增加，获得的底物转化率也增加。当甘油质量浓度达到2%时，转化率达到最大值。如果甘油浓度进一步增加，则底物转化率显着降低。这可能有两个原因：一是甘油在酵母细胞中分解代谢产生一系列氢受体，这些氢受体将与苯乙酮竞争活性氢；另一个原因是高浓度甘油造成了高渗透压环境，从而抑制细胞内的酶活性。考虑到甘油浓度对产物e.e.值的影响较小，最终确定最适辅助底物甘油的浓度为2%。

3.3 转化温度和初始反应pH值对不对称还原反应的影响

温度对酶促反应的影响是双刃剑，如图3（a）所示，随着转化温度的升高，底物转化率也随之增加，而当温度达到30 ℃时，转化率达最大值，当温度继续升高，获得的底物转化率逐渐下降。这是因为酶蛋白在高温条件下容易变性、失活。考虑到温度对产物e.e.值影响很小。故确定不对称还原反应的最佳温度为30 ℃。

反应体系的初始pH不仅影响底物分子的电离状态，还影响酶的催化活性。因此，在不同pH磷酸盐缓冲液中研究了Y. lipolytica CCTCC CM2013606细胞的催化活性。由图3（b）可知，在pH7.0磷酸盐缓冲溶液中底物转化率和产物e.e.值均达最大值。因此，不对称还原反应的最佳初始pH值为7.0。

3.4 菌体细胞浓度和底物浓度对不对称还原反应的影响

在反应体系中，微生物细胞的增加可被认为是催化剂数量的增加，从而加速催化进程，这也是底物转化率随细胞浓度增加而提高的原因所在。如图4（a）所示，当细胞浓度增加至0.25 g/mL时，底物转化率为最大值。此时，如果菌株细胞数量再增加，则底物转化率变化不大，原因可能是反应体系体积较小，过大的细胞浓度使得菌体细胞不能很好地分散其中，导致实际起到催化作用的菌体细胞数量并没有增加。鉴于菌体细胞浓度对产物e.e.值几乎无影响，最终确定最适细胞浓度为0.25 g/mL。

另外，为获得更多产物，不断尝试增加反应体系中的底物浓度。当底物浓度增加至45 mmol/L时，获得的转化率达到最大值。如果底物浓度进一步增加，则转化率会降低（见图4（b））。这是因为底物苯乙酮为有机化合物，如果浓度过大将对菌体细胞产生毒性抑制，从而抑制胞内氧化还原酶的活性。因底物浓度对产物e.e.值影响不大，最适底物浓度确定为45 mmol/L。

3.5 底物助溶剂对不对称还原反应的影响

因底物为有机化合物，为进一步提高其溶解度，分别向反应体系中加入少量与水互溶的有机溶剂。反应体系中加入2%乙醇时，获得的底物转化率为96.96%，产物e.e.值为94.82%（见图5）。与空白对照相比，底物转化率略有增加。这是因为乙醇可帮助底物更好地分散在水相中，促进底物和菌株细胞间的接触，从而加速催化反应进程。当反应体系中添加吐温80和PEG4000时，底物转化率明显减少，分析原因可能是这些有机溶剂对菌株细胞有一定的毒性抑制作用。由此可见，Y. lipolytica CCTCC CM2013606对乙醇具有一定的耐受性。

4 结束语

本文系统研究了Y. lipolyticaCCTCC CM2013606不对称还原苯乙酮合成为（R）-苯乙醇的各种影响因素，建立的最佳转化条件为30℃，pH7.0，2%甘油为辅助底物，菌体细胞浓度为0.25 g/mL（湿重），底物浓度为45 mmol/L，并加入2%乙醇的底物助溶剂，转化36 h后获得的底物转化率和产物e.e值最高可达96.96%和94.82%。

为进一步提高产物e.e.值，研究中尝试将Y.lipolytica CCTCC CM2013606全细胞在60 ℃下保温3 min后再加入到转化反应体系中，其他转化条件不变的情况下获得的产物e.e.值增加至> 99%，但此时底物转化率下降至78.4%。我们推断在Y.lipolytica CCTCC CM2013606菌体细胞中可能存在两种氧化还原酶。一种酶的催化产物为（S）-构型，另一种酶的催化产物为（R）-构型。菌体细胞经热处理后，胞内这两种酶对温度的敏感性不同，（S）-构型酶对温度更敏感、热处理后失活，而（R）-构型酶对温度具有一定抗性，仍保留部分酶活性。这与Napora-Wijata K等^[22]研究结论一致。他们的研究表明在一个菌株细胞中确存在两种还原酶ADH2和YISDR，催化相同底物时可获得两个相反构型的产物。因此，下一步将寻找适合的温育条件，以达到抑制（S）-构型酶活性的同时不降低（R）-构型酶活性的目的，为生物催化不对称合成手性药物及其中间体的工业化应用奠定基础。