甲氧苄啶属于广谱抗菌药，有抑制二氢叶酸还原酶的作用，但细菌较易产生耐药性，很少单独使用。甲氧苄啶通常作为可抑制二氢叶酸合成酶的磺胺类药物增效剂，与磺胺类或其他抗生素配合使用，可以使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，抗菌作用增强几倍甚至几十倍^{[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]}。正是由于其独特的作用，甲氧苄啶在养殖业病害防治中被广泛应用^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}。

根据中华人民共和国农业部农办质[2011]1号文件要求，自2011年4月1日起，必须对所有新申报无公害农产品的淡水鱼开展甲氧苄啶含量检验项目，限量要求为50 μg/kg。

本文通过研究简化了样品前处理步骤、优化了仪器分析条件，建立了固相萃取-高效液相色谱法检测水产品中甲氧苄啶残留量的分析方法。

试验用鳕鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；冷冻虾仁，去头、去壳、去肠腺，取肌肉部分。样品充分绞碎、混匀，于-20 ℃冷冻保藏。试验所用水产品均购自市场。

高效液相色谱，配有DAD检测器（AgiLent1100，美国安捷伦公司）；旋转蒸发仪（R-210型，瑞士步琦有限公司）；离心机（3-30K型，德国Sigma实验室离心机股份有限公司），超声波清洗仪（DL-720B，上海之信仪器公司）；水浴恒温振荡器（金坛市开发区吉特实验仪器厂）；固相萃取柱（ProElut PXC，150 mg/6 mL，北京迪马科技有限公司）。

甲氧苄啶标准品（Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇（分析纯），三氯甲烷（分析纯），丙酮（分析纯），乙酸（分析纯），乙酸铅（分析纯）；试验用水应符合GB/T 6682——2008《分析实验室用水国家标准》一级水的标准。

取适量新鲜或解冻的鱼、虾等水产品，用剪刀剪取适量肌肉，放入机器中搅碎并使之均质，准确称取5.0 g样品，依次加入5%乙酸水∶甲醇溶液（70∶30，ν:ν）15 mL、200 g/L乙酸铅1 mL和三氯甲烷7 mL，混匀，涡旋2 min后超声提取5 min，在8 000 r/min下离心2 min，收集上清液；将下层残留物再依次加入5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν:ν）15 mL、200 g/L乙酸铅1 mL按照上述步骤重复提取一次，合并两次上清液，待净化。

固相萃取柱依次加入甲醇5 mL及5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν:ν）溶液5 mL进行活化，将待净化提取液全部加入经过活化的固相萃取柱，弃去流出液；再依次加入5 mL的5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν:ν）溶液和5 mL甲醇进行淋洗，弃去流出液；再加入5 mL的5%氨水甲醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在40 ℃下减压蒸馏至近干，用流动相溶液重新溶解样品并定容至1 mL，备用，供HPLC分析。

色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；进样量为20 μL；流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为230 nm；流动相为0.1%甲酸水溶液∶甲醇（80∶20，ν:ν）。

主要对提取条件及固相萃取柱净化条件进行了优化。在提取操作中，采用5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν:ν）、乙酸铅（200 g/L）和三氯甲烷的混合液对水产品中的甲氧苄啶进行了有效提取，不需调整pH值、二氯甲烷反萃等复杂步骤，提取步骤大大简化；在固相萃取中，经过分析发现，用5 mL甲醇、5 mL 5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν:ν）活化固相萃取柱，用5 mL 5%氨水甲醇溶液的洗脱效果最好；高效液相色谱检测条件的优化是使样品色谱峰取得较好的分离效果且干扰最小，并在此基础上进一步优化其他参数。对二极管阵列检测器波长扫描选择最大吸收波长，考察了Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）、Envirosep-CM（175mm×3.2 mm×5 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm）3种色谱柱对标样的分离情况，并进行了流动相种类和流速等条件的选择，实验结果表明，色谱柱，Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液∶甲醇=80∶20（ν:ν）；流量1.0 mL/min；检测波长230 nm；柱温为30 ℃时，可满足分析的要求。

对0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/L的标准溶液进行测定，绘制工作曲线（见图 1），相关系数r²=0.999 3，可以看出其工作曲线在需要的线性范围内呈现良好的线性关系。以信噪比S/N=3时对应的甲氧苄啶含量确定的检出限为0.02 mg/L，检出限较低，表明该方法的灵敏度较好。

图 1 甲氧苄啶标准曲线

图选项

分别以鳕鱼和虾仁两种水产品为基质，在0.02，0.20 mg/L两个质量浓度水平上做加标回收试验，每个添加做5个平行，得到方法的回收率和精密度如表 1所示。可以看出，两种基质在两个浓度水平上回收率都比较好，说明该方法准确度较高；相对标准偏差RSD值均较小，表明该方法的重复性良好。

表 1 方法回收率及精密度

表选项

从市场购买了鳕鱼和虾仁各5个样品，按本文所建立的方法进行测定，结果和色谱图分别如表 2和图 2所示。由表可知，目前市场上鳕鱼和虾仁中甲氧苄啶残留量安全状况良好，虽然有两例阳性样品，但结果均低于我国要求的0.05 mg/L的限量值。由图 2可以看出，在实际样品检测过程中，虽然甲氧苄啶含量较低，但其色谱图峰型良好，与周边杂质色谱峰能够完全分开，表明该方法具有很好的可靠性。

表 2 鳕鱼和虾仁样品中甲氧苄啶的分析结果

表选项

图 2 鳕鱼样品中甲氧苄啶检测液相色谱图

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本文采用5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν:ν）、乙酸铅（200 g/L）、三氯甲烷混合液对水产品中的甲氧苄啶进行了有效提取，固相萃取柱净化，并建立了一种高效液相色谱法对甲氧苄啶进行了定性定量分析。所建立的方法具有良好的精密度和准确度，并且与我国国家标准GB 29702——2013《食品安全国家标准水产品中甲氧苄啶残留量的测定高效液相色谱法》相比，本方法提取步骤大大简化，不需经过调整pH值、二氯甲烷反萃等复杂步骤即可完成甲氧苄啶提取；实验成本大大降低，固相萃取柱只用5 mL氨水甲醇洗脱，远低于国标方法中15 mL洗脱液用量；杂质干扰大大减少，加标回收率达80%以上，保证实验结果的准确性、重现性。该方法可为水产品的日常检测及监管部门的监督抽查提供科学依据，具有良好的应用前景。